Лабораторная диагностика


УДК 615.33.032

Бактерии рода Leuconostoc: клиническое значение, идентификация, чувствительность к антибиотикам

Л.И. Ахметова, Е.Ю. Перевалова, С.М. Розанова

Центр лабораторной диагностики, г. Екатеринбург, Россия

В настоящее время ванкомицин во многих случаях является препаратом выбора для терапии тяжелых инфекций, вызванных грамположительными кокками. Более того, он часто бывает единственным эффективным препаратом в отношении множественно-устойчивых штаммов бактерий. В связи с этим важна идентификация редко встречающихся в клинической практике микроорганизмов, обладающих природной устойчивостью к ванкомицину, в частности бактерий рода Leuconostoc. Это позволит не только назначить адекватную антимикробную терапию, но и поможет избежать ошибочных заявлений о выделении ванкомицинорезистентных штаммов стрептококков, пневмококков и энтерококков.

В статье представлены схемы идентификации представителей рода Leuconostoc и описание клинического случая бактериемии, вызванного данным микроорганизмом.

Ключевые слова: лейконосток, ванкомицин, микробиологическая диагностика, идентификация, бактериемия.



Genus Leuconostoc: Clinical Significance, Identification, Susceptibility to Antimicrobials

L.I. Ahmetova, E.J. Perevalova, S.M. Rozanova

Microbiological Laboratory of Center of Laboratory Diagnostics, Ekaterinburg, Russia

In many cases vancomycin is a drug of choice for the treatment of serious gram-positive infections and what is more important vancomycin is often the only antimicrobial agent that active against multiresistant strains. In this connection the correct identification of intrinsically vancomycin-resistant bacteria that quite uncommon in clinical practice, in particular Leuconostoc spp., is important. Prompt identification of this bacterium will lead not only to administration of adequate antibiotic therapy but also to avoid the mistaken reports about vancomycin resistance in streptococci, enterococci and other streptococcus-like bacteria.

Approaches to identification of Leuconostoc are presented. One case of Leuconostoc bacteremia is described.

Key words: Leuconostoc, vancomycin, laboratory diagnosis, identification, bacteremia.


Введение

Широкое использование антибактериальных препаратов в клинической практике приводит к селекции высокорезистентных штаммов микроорганизмов. Так, следствием широкого применения b-лактамных антибиотиков явилось распространение метициллинорезистентных стафилококков и устойчивых к ампициллину энтерокококков. Препаратом выбора для лечения инфекций, вызванных этими часто встречающимися в клинической практике возбудителями, является ванкомицин.

До настоящего времени в России не было достоверных сообщений о выделении ванкомицинорезистентых штаммов энтерокококков и стафилококков со сниженной чувствительностью к ванкомицину. В то же время необходимо помнить о возможности инфицирования относительно редко встречающимися в клинической практике микроорганизмами с природной устойчивостью к ванкомицину, среди которых наибольшее значение имеют бактерии рода Leuconostoc.

Общая характеристика бактерий рода Leuconostoc

Стрептококкоподобные бактерии рода Leuconostoc из клинического материала впервые выделены Handwerger в середине 80-х годов прошлого века [1].

Leuconostoc spp. – грамположительные, каталазонегативные, неспорообразующие, неподвижные, гетероферментативные факультативно-анаэробные кокки, широко распространенные в окружающей среде, включая почву и растения [2, 3].

Род Leuconostoc включает "типичного представителя" L.mesenteroides и 8 "второстепенных" видов – L.pseudomesenteroides, L.lactis, L.citreum, L.gelidum, L.carnosum, L.fallax, L.argentinum и L.oenos. Два других ранее существовавших вида, L.cremoris и L.dextranicum, упразднены в связи с тем, что генетически являются не более чем подвидами L.mesenteroides. А упомянутый вид L.pseudomesenteroides, возможно, будет выделен в новый род Wesella (W.pseudomesenteroides) [3].

Благодаря использованию молекулярных методов исследования, установлено, что вид L.oenos генетически достаточно далек от остальных представителей рода Leuconostoc. В связи с этим предложено перенести его в новый род Oenococcus как О.oeni [3].

L.mesenteroides и L.lactis изолируются преимущественно из молока и молочных продуктов. L.oenos был выделен только из вина. L.pseudomesenteroides и L.citreum обнаруживаются на растениях, овощах и в молочных продуктах. L.gelidum и L.carnosum чаще всего выделяются из мяса и мясных продуктов, L.fallax – из консервированных овощей. L.argentinum изолирован из непастеризованного молока в Аргентине, как следует из названия [3].

Клиническое значение бактерий рода Leuconostoc

Представители рода Leuconostoc имеют скорее экономическое, чем клиническое значение, поскольку они используются в изготовлении некоторых молочных продуктов и вина. Однако в последние годы эти микроорганизмы все чаще выделяются при инфекциях в основном от пациентов с иммунодефицитными состояниями.

В литературе описаны случаи выделения Leuconostoc spp. из крови больных со злокачественными новообразованиями и длительной катетеризацией, из интраабдоминальных абсцессов и абсцессов печени, а также из раневого отделяемого при послеоперационных инфекциях и при одонтогенных абсцессах [4–8]. Описан также случай гнойного менингита, вызванного Leuconostoc spp. у 16-летней, ранее здоровой, пациентки [8].

Другой группой риска, возможно, даже более важной, чем пациенты с иммуносупрессией, являются новорожденные и дети первых лет жизни. Так, I.R. Friedland et al. описали случай гнойного менингита, вызванного Leuconostoc mesenteroides у месячного ребенка [9], а J. Carapetis et al. – 2 случая бактериемии Leuconostoc spp. у детей с некротизирующим энтероколитом, длительно получавших парентеральное питание [10]. Более того, описано несколько случаев бактериемии, связанной с употреблением детского питания, контаминированного L.mesenteroides [11].

Дополнительными факторами, предрасполагающими к заражению, являются: длительное госпитальное лечение, применение устройств (венозных катетеров, гастро- или трахеостомы, дренажных фистул), нарушающих целость кожи и слизистых оболочек, обширные хирургические вмешательства, снижение барьерной функции кишечника, предшествующая антибактериальная терапия препаратами, недостаточно активными в отношении лейконостока [1, 12-15].

Следует признать, что инфекционные заболевания, вызванные Leuconostoc spp., регистрируются редко. Это связано не только с тем, что данный микроорганизм действительно имеет невысокое клиническое значение, но и с отсутствием практики его выделения, в основном в связи с недостаточным уровнем знаний лабораторных работников.

Сложность идентификации также связана и со сходством некоторых свойств данного микроорганизма с другими, более распространенными бактериями – пневмококками, зеленящими стрептококками, особенно Streptococcus sanguis II, и лактобактериями, что может быть причиной лабораторных ошибок [316].

Среди факторов патогенности Leuconostoc spp. известен лейкоцидин J (бактерицин), инактивирующий протеолитические ферменты и бактерицидный в отношении лактобактерий и некоторых других микроорганизмов [17, 1819]. Однако в целом "классических" факторов патогенности, таких, как продукция токсинов, у представителей рода Leuconostoc не выявлено.

Активность антибактериальных препаратов в отношении Leuconostoc spp.

Лейконосток принадлежит к немногим грамположительным бактериям, включая Pediococcus spp., Lactobacillus spp., Erysipelothrix spp. и некоторые энтерококки, природно-резистентным к гликопептидным антибиотикам – ванкомицину и тейкопланину.

Природная устойчивость представителей рода Leuconostoc к гликопептидам связана с тем, что концевой участок пентапептида, используемого для построения клеточной стенки лейконостока, представлен депсипептидом аланин-лактат, а не дипептидом аланин-аланин, как у чувствительных к ванкомицину бактерий.

Однако, несмотря на резистентность к гликопептидам, Leuconostoc spp. чувствителен к большинству антибиотиков, активных в отношении стрептококков. Так, лейконосток обычно чувствителен к пенициллину, ампициллину, клиндамицину, эритромицину и фосфомицину [1416]. Показана также активность in vitro нового кетолида HMR3 647 [20]. Умеренную активность проявляют имипенем, цефалоспорины, тетрациклины и хлорамфеникол [1416].

Интересно, что, кроме природной резистентности к ванкомицину, бактерии рода Leuconostoc обладают рядом других уникальных свойств. Так, L.mesenteroides резистентен к фитонцидам чеснока, а L.oenos – к низким значениям рН среды (рН 2,6) [2122].

Крайне лимитированные клинические данные свидетельствуют, что, по-видимому, препаратом выбора для терапии инфекций, вызванных Leuconostoc spp., является пенициллин или ампициллин [116]. Однако следует учитывать, что встречаются штаммы лейконостока со сниженной чувствительностью к этим антибиотикам [14].

Лабораторная диагностика

Клиническое значение имеет выделение Leuconostoc spp. только из заведомо стерильных источников (кровь, ликвор, перитонеальная и суставная жидкости) при соблюдении всех правил асептики и антисептики. Если же лейконосток обнаружен в материале, вероятность контаминации которого высока (например, в отделяемом из раны), клиническое значение данный факт имеет только в том случае, если не обнаружено никаких других более вирулентных микроорганизмов или если лейконосток в большом количестве выделяется при нескольких анализах последовательно взятого материала [114].

Забор, транспортирование и хранение клинического материала. Не описано кaкиx-либo специфических требований, предъявляемых к забору, транспортированию и хранению клинического материала для исследования его на наличие бактерий рода Leuconostoc. Поскольку лейконосток является факультативным анаэробом, для него приемлемы рутинные методы, принятые для неанаэробных бактерий [1].

Выделение из клинического материала. Культура Leuconostoc sрр. может быть выделена при рутинном исследовании клинического материала. Никаких специальных питательных сред и условий для культивирования не требуется. Данный микроорганизм хорошо растет на обычных обогащенных неселективных средах, таких, как кровяной и шоколадный агар [12324].

Идентификация. На кровяном агаре лейконосток формирует мелкие колонии с альфа-гемолизом (в этом случае они очень похожи на зеленящие стрептококки) или без гемолиза.

Тест на наличие каталазы дает отрицательный результат.

При окраске по Граму лейконостоки представляют собой грамположительные кокки, располагающиеся в виде цепочек, особенно тогда, когда мазок сделан с жидкой питательной среды. Правильное проведение микроскопии крайне важно, поскольку она также в большинстве случаев позволяет дифференцировать лейконосток от лактобактерий.

Основная проблема идентификации представителей рода Leuconostoc состоит в том, что данные микроорганизмы часто могут быть ошибочно идентифицированы как зеленящие стрептококки (особенно Streptococcus sanguis II), пневмококки, энтерококки или лактобактерии. Это обстоятельство приводит к ошибочным утверждениям о появлении ванкомицинорезистентных штаммов стрептококов, пневмококков и энтерококков.

В табл. 1 приведены основные отличительные свойства стрептококков и стрептококкоподобных бактерий, включая лейконосток.


Таблица 1. Идентификация стрептококков и стрептококкоподобных бактерий [3]

Наименование рода бактерий Чувст-
витель-
ность
к ванко-
мицину
Kата-
лаза
Про
дукция газа из глю-
козы
ЛАП ПИР Гидро- лиз эску-
лина
Рост в 6,5% раст-
воре NaCl
Гидро-
лиз арги-
нина
Рост при температуре
10oС 45oС
Streptococcus Ч - - + - В В В - -(+)
Enterococcus Ч (Р) - - + + + + В + +
Lactococcus Ч - - + + +(-) В - + -
Aerococcus Ч - - В В - + - В -
Leuconostoc Р - + - - В В - + В
Pediococcus Р - - + - +(-) В В - В
Gemella Ч - - В В - - - - -
Alloiococcus Ч + - + + - + - - -
Vagococcus Ч - - + +(-) + +(-) В + -
Tetragenacoccus Ч - - + - ? ? ? - -
Globicatella Ч - - - + + + - - -
Helcococcus Ч - - - + + В - ? ?
Примечание: ЛАП–лейцинаминопептидаза, Ч–чувствительный, "+"–положительный результат,
"+(–)"–большинство штаммов дают положительный результат, В–вариабельный результат,
ПИР–пирролидонил бета нафтиламид, Р–резистентный, "–"–отрицательный результат, "–(+)"–большинство штаммов дают отрицательный результат, ?–нет данных.


Природная резистентность Leuconostoc spp. к ванкомицину позволяет быстро дифференцировать данный микроорганизм от большинства других стрептококкоподобных бактерий, за исключением Pediococcus spp. и ванкомицинорезистентных штаммов энтерококков, дифференциальная диагностика которых приведена в табл. 2.


Таблица 2. Дифференциация ванкомицинорезистентных стрептококкоподобных бактерий [25]

Наименование рода бактерий Устойчивость к ванкомицину Гидролиз
L-пирролидонил-
бета-нафтиламида
(ПИР-тест)
Наличие фермента лейцинаминопептидазы
Leuconostoc + - -
Enterococcus * + + +
Pediococcus + - +

* Большинство штаммов чувствительны



В табл. 3 представлена видовая идентификация представителей рода Leuconostoc.


Таблица 3. Идентификация видов бактерий рода Leuconostoc [3]

Тест L.mesente-
roides ss. mesente-
roides
L.mesente-
roides ss. dextra-
nicum
L.mesente-
roides ss. cremoris
L.(W.) para-
mesente- roides
L.pseudo-
mesente-
roides
L.citreum
Желтый пигмент - - -(+) - -(+) +
Рост при температуре:
    10oС ? ? ? ? + +
    37oС +(-) + - +(-) + -(+)
    45oС - ? ? ? - -
Гидролиз эскулина +(-) +(-) - +(-) + +
Декстран из сахарозы + + - - ? ?
Кислота из:
    амигдалина В В - - -(+) +(-)
    L-арабинозы +(-) - - + +(-) +
    арбутина ? - - - -(+) +
    целлобиозы +(-) В - В +(-) +
    фруктозы + + В + + +
    галактозы +(-) В +(-) + +(-) -(+)
    b-гентобиозы В ? - -(+) В +
    глюконата В ? - + В +
    глюкозы + + + + + +
    лактозы В + В - В -
    мальтозы + + -(+) + + +
    маннитола +* В - +* -(+) В
    маннозы + В В + + +
    мелибиозы + В -(+) + +(-) -
    раффинозы +(-) В -(+) -(+) +(-) -
    рибозы +(-) ? -(+) + + -
    салицина + В - -(+) В +
    крахмала - - - - +* -
    сахарозы + + ? + +(-) +
    трегалозы + + ? + + +
    туранозы +(-) ? - + +(-) +
    ксилозы + В -(+) - + -(+)
Откуда чаще выделяется Молочные продукты, овощи Молочные продукты Молочные продукты Молочные продукты Растения, овощи, молочные продукты Растения

Продолжение Таблицы 3.

Тест L.lactis L.(O)enos L.gelidum L.car-
nosum
L.fallax L.argen-
tinum
Желтый пигмент - - - - - -
Рост при температуре:
    10oС ? ? + + + +
    37oС + +(-) -(+) -(+) + +
    45oС - ? - - - -
Гидролиз эскулина -(+) + + -(+) ? -
Декстран из сахарозы - - В + ? -
Кислота из:
    амигдалина - ? + - - -
    L-арабинозы -(+) В + - - В
    арбутина - ? + - - -
    целлобиозы - В + В - В
    фруктозы + + + + + +(-)
    галактозы + В - - - +
    b-гентобиозы - ? ? ? ? В
    глюконата - ? - - ? -
    глюкозы + + + + + +
    лактозы + - - - - +
    мальтозы + - В в + +
    маннитола - - - - +* В
    маннозы + В + В + +
    мелибиозы +(-) + + В - +
    раффинозы +(-) - + - - +(-)
    рибозы - ? В В + -
    салицина - + + В - -
    крахмала - ? ? ? ? -
    сахарозы + - + + + +
    трегалозы В + + + +* В
    туранозы - ? ? ? + В
    ксилозы - В - - - В
Откуда чаще выделяется Молочные продукты Вино Мясо и мясные продукты Мясо и мясные продукты Консер-
вирова-
нные овощи
Непастери-
зованное молоко
(в Аргентине)

Примечание:
"+" – положительная реакция,
"+(–)" – большинство штаммов дает положительную реакцию,
"–(+)" – большинство штаммов дает отрицательную реакцию,
"?" – нет данных,
"*" – положительная реакция, но медленная или слабовыраженная,
"–" – отрицательный результат, В–вариабельный результат.



Случай из практики

В микробиологической лаборатории Центра лабораторной диагностики г. Екатеринбурга в 1998 г. была выделена культура Leuconostoc spp. из крови ребенка (возраст – 23 дня) с диагнозом "энтероколит". Ранее в литературе были описаны аналогичные случаи обнаружения Leuconostoc spp. у грудных детей с патологией желудочно-кишечного тракта, в основном с некротическим энтероколитом.

Для бактериологического исследования крови, идентификации и определения чувствительности возбудителя к антибиотикам в лаборатории применяли микробиологические анализаторы "Bactec-9240" и "Sceptor" (Becton Dickinson, США). Выделенная культура идентифицирована как Streptococcus agalactiae. Она оказалась резистентной к ванкомицину и чувствительной к пенициллину и ампициллину.

После получения столь необычного результата на автоматизированной системе дополнительно были выполнены следующие тесты: CAMP-тест (для подтверждения вида S.agalactiae), серотипирование, определение чувствительности диско-диффузионным методом к ранее тестированым антибиотикам. В результате микроорганизм идентифицирован как зеленящий стрептококк, чувствительный к пенициллину и резистентный к ванкомицину. В то же время результаты серотипирования показали, что данный микроорганизм, по-видимому, имеет G-групповой антиген.

Для подтверждения результата выделенную культуру направили в Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии*, где методом Е-тестов была определена чувствительность к антибиотикам. Данный микроорганизм действительно был резистентен к гликопептидным антибиотикам – ванкомицину (МПК >256 мг/л) и тейкопланину (МПК >256 мг/л). В то же время он был чувствителен к ампициллину (0,5 мг/л). В дальнейшем данный штамм был отправлен в бактериологическую лабораторию Центрального госпиталя г. Лиона (Франция)*, где на автоматическом анализаторе (BioMerieux, Франция) культура была окончательно идентифицирована как Leuconostoc spp.



Авторы выражают признательность за содействие в работе сотрудникам Научно-исследовательского института антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии и M. Chomarat (Hospices civils de Lyon, France)




Л и т е р а т у р а

  1. Ruoff K.L. Leuconostoc, Pediococcus, Stomatococcus, and miscellaneous gram-positive cocci that grow aerobically. In: Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H., editors. Manual of clinical microbiology. 7th ed. Washington: ASM Press; 1999. р. 306-16.
  2. Farias M.E., Rollan G.C., De Nadra M.C.M. Influence of nutritional factors on the protease production by Leuconostoc oenos from wine. J Appi Bacteriol 1996; 81:398-402.
  3. The Gram-positive cocci: part II: Streptococci, Enterococci, and the "streptococcus-like" bacteria. In: Koneman E.W., Alien S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C., editors. Color Atlas and textbook of diagnostic microbiology. Philadelphia: Lippincott; 1997. p. 577-651.
  4. Bernardo de Quiros J.C.L., Munoz P., Cercenado E. Leuconostoc species as a cause of bacteremia: two case reports and a literature review. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1991;10:505-9.
  5. Giraud P., Attal M., Lemouzy J., et al. Leuconostoc: a potential pathogen in bone marrow transplantation. Lancet 1993; 341:1481-2.
  6. Golledge C.L. Infection due to Leuconostoc species. Rev Infect Dis 1991; 13:184-5.
  7. Hardy S., Ruoff K.L., Catlin E.A., et al. Catheter-associated infection with a vancomycin-resistant gram-positive coccus of the Leuconostoc sp. Pediatr Infect Dis J 1988; 7:519-20.
  8. Coovadia Y.M., Solwa Z., van den Ende J. Meningitis caused by vancomycin-resistant Leuconostoc spp. J Clin Microbiol 1987; 25:1784-5.
  9. Friedland I.R., Snipelisky M., Khoosal M. Meningitis in a neonate caused by Leuconostoc spp. J Clin Microbiol 1990; 28:2125-6.
  10. Carapetis J., Bishop S., Davis J. Leuconostoc sepsis in association with continuous enteral feeding: two case reports and a review. Pediatr Infect Dis J 1994; 13:816-23.
  11. Noriega F.R., Kotloff K.L., Martin M.A. Nosocomial bacteriemia caused by Leuconostoc mesenteroides and Enterobacter sakazakii resulting from extrinsic contamination of infant formula. Pediatr Infect Dis J 1990; 9:447-9.
  12. Jimenez-Mejias M.E., Becerril В., Gomez-Cia Т., Del Nozal M., Palomino-Nicas J. Bacteremia caused by Leuconostoc cremoris in a patient with severe burn injuries. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997; 16:533-5.
  13. Borer A., Weber G., Avnon L.S., Riesenoerg K., Alkan M. Pleural empyema caused by Leuconostoc spp. Scand J Infect Dis 1997; 29:311-2.
  14. Cappelli E.A., Barros R.R., Camello T.C.F., Teixeira L.M., Merquior V.L.C. Leuconostoc pseudomesenteroides as a cause of nosocomial urinary tract infections. J Clin Microbiol 1999; 37:4124-6.
  15. Dhodapkar K.M., Henry N.K. Leuconostoc bacteremia in an infant with short-gut syndrome: Case report and literature review. Mayo Clin Proc 1996; 71:1171-4.
  16. Moellering R.C. Enterococcus species, Streptococcus species, Leuconostoc species. In: Madell G.L, Bennett J.E., Dolin R., editors. Principles and practice of infectious diseases. 5th ed. 2000. p. 2147-56.
  17. Kimchi, Choi H.J., Lee H.S., Her S., Oh D.H., Yoon S.S. Partial characterization and cloning of leuconocin J, a bacteriocin produced by Leuconostoc sp. J2 isolated from the Korean fermented vegetable. J Appi Microbiol 1999; 86:175-81.
  18. Krier F., Revol-Junelles A.M., Germain P. Influence of temperature and pH on production of two bacteriocins by Leuconostoc mesenteroides subspp. mesenteroides FR52 during batch fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 1998; 50:359-63.
  19. Dayem M.A., Fleury Y., Devilliers G., Chaboisseau E., Girard R., Nicolas P., Delfour A. The putative immunity protein of the Gram-positive bacteria Leuconostoc mesenteroides is preferentially located in the cytoplasm compartment. FEMS Microbiol Lett 1996; 138:251-9.
  20. Zarazaga M., Saenz Y., Portillo A., Tenorio C., Ruiz-Larrea F., Del Campo R., Baquero F., Torres, С. In vitro activities of ketolide HMR3647, macrolides, and other antibiotics against Lactobacillus, Leuconostoc, and Pediococcus isolates. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:3039-41.
  21. Kyung K.H., Park K.S., Kim Y.S.J. Food Isolation and characterization of bacteria resistant to the antimicrobial activity of garlic. Science 1996; 61:226-9.
  22. Drici-Cachon Z., Guzzo J., Cavin J.F., Divies C. Acid tolerance in Leuconostoc oenos. Isolation and characterization of an acid-resistant mutant. Appl Microbiol Biotechnol 1996; 44:785-9.
  23. Bellengier P., Richard J., Foucaud С. Nutritional requirements of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides and subsp. dextranicum for growth in milk. J Dairy Res 1997; 64:95-103.
  24. Foucaud С., Francois A., Richard J. Development of a chemically defined medium for the growth of Leuconostoc mesenteroides. Appl Environ Microbiol 1997; 63:301-4.
  25. Facklam R.R., Pigot N., Franklin R., et al. Evaluation of three disk tests for identification of Enterococci, Leuconostoc and Pediococci. J Clin Microbiol 1995; 33:885-7.